【技术分享】水产动物细菌分离培养及注意事项

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水产动物细菌分离培养及注意事项

范芯铭

       细菌是原核微生物的一类，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖。水产动物细菌病多种多样，不同病原菌感染症状也有所不同，从患病个体（如鱼、虾、蟹等）体内成功分离出病原菌，是诊断细菌性疾病、开展药敏试验和制定精准治疗方法的关键步骤。未能及时分离出病原菌，就不能准确诊断病因，这会耽误最佳治疗时机。2025年收到药店大量被污染的平板，反映出细菌分离操作中仍存在诸多不规范之处。为提升分离效果、减少污染，下面笔者就水产动物细菌分离的规范方法及关键注意事项进行系统说明，希望对大家有所帮助。
       一、样品采集原则
       优先采集活体或刚死亡的个体，死亡时间越短，病原活性越高，杂菌污染越少。采集具有典型症状或明显病灶的个体，如溃疡、出血、腹水、肝胰腺坏死等。
       二、选择合适的培养基
       在对水产动物细菌进行分离培养前，应充分考虑目标菌的生物学特性，尤其是其对营养的需求高低，从而选择最适宜的培养基。公司目前提供三种常用培养基（图1）：硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和脑心浸液琼脂（BHI）。BHI培养基营养丰富，特别适合对营养要求较高的细菌，如链球菌；TCBS培养基含有选择性抑制成分，能有效抑制非弧菌类细菌的生长，是分离弧菌（如副溶血弧菌、哈维氏弧菌等）的理想选择；TSA培养基营养适中，适用于大多数细菌的培养，如气单胞菌属和爱德华氏菌属等。根据目标菌的营养特性和生长需求合理选用培养基，可显著提高细菌分离的成功率与特异性，为后续鉴定和药敏试验奠定可靠基础。

图1  三种不同种类的培养基

       三、严格无菌操作所有操作
       应在酒精灯火焰附近进行（火焰周围形成无菌区）。在细菌分离过程中，所使用的剪刀、接种环等器械必须经过严格灭菌处理。接种环灼烧灭菌后需冷却（可在无菌琼脂边缘轻触降温），避免高温烫死细菌。
       四、细菌分离方法
       通过药店寄送的培养皿，我们发现许多药店工作人员并不熟悉细菌分离技术，因此难以成功分离出纯净的细菌样本（图2左）。这表明在细菌分离的专业技能方面，存在明显的培训需求和操作规范上的差距。为了确保能够获得准确、可靠的病原菌检测结果，提高相关人员的技术水平显得尤为重要。目前常用方法是连续划线法和分区划线法，连续划线分离法，适用于致病菌含量不多的样品（图2中）；而分区划线分离法，则适用于致病菌数量较多的样品。涂布法较难获得分散良好的单菌落，因此在细菌分离中较少使用（图2右）。
       划线法操作方法是在固体培养基表面进行划线（分区划线法第一区划线后，灼烧接种环冷却，再从第一区末端开始划第二区），左手拿琼脂培养皿，打开培养皿，使之与水平面成45度角；右手拿接种环，将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，插入检测材料（水产动物的肝脏、脾脏、肾脏、脑等组织），划线接种于琼脂培养基上。划线完毕后，将接种环灼烧灭菌，在培养皿上标记客户名称、样品来源、分离部位及分离日期。

左：被污染平板；中：连续划线法；右：分区划线法
图2  细菌分离划线方法

       五、合理使用培养基
       在使用培养基进行细菌分离时，应科学合理地规划平板的使用。若需对同一动物的不同组织（如肝与脾）进行对比，可将一块培养皿最多划分为两个区域，分别接种不同组织样本。但不宜进一步细分，因为分区过多会显著增加操作难度，划线过程中接种环极易跨越区域边界，导致不同来源的菌群交叉污染，不仅难以准确追溯菌落来源，还会影响单菌落的分离效果，从而降低诊断的准确性与可靠性。

图3  细菌分离培养基使用

     七、注意事项
       ①全程无菌操作：工具每次使用前后必须灼烧灭菌；操作时必须靠近酒精灯火焰，在火焰附近操作；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。
       ②培养基选择合理：如怀疑弧菌，必须用TCBS；怀疑链球菌，建议用BHI。
       ③不建议将组织直接涂布于平板，因其表面常携带大量杂菌，极易造成污染，干扰目标病原菌的分离与鉴定。
       ④细菌接种过程中，要保证接种环与组织充分接触。如果接种环未接触到组织，会影响细菌的分离效果。在操作时，可以使用小剪刀在组织上剪开一个小口，以便接种环能够直接插入到组织内部，避免表面杂菌污染。
       ⑤培养时，要在合适的温度下培养（水产动物一般在29℃培养），避免因温度过高或过低导致分离不出细菌。

（转自“利洋水产”微信平台）

刚子

规范操作，科学检测

小丑鱼

规范操作，准确分离致病菌。如果送检一份污染的样品，没有意义，且浪费运输成本，所以从源头上做到规范操作，划线，最终的送检才有价值。