【虾类专题】虾肝肠胞虫（EHP）组织印片的快速观察诊断

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虾肝肠胞虫（EHP）组织印片的快速观察诊断

张会军、肖冬娇、雷燕、陈志和

       虾肝肠胞虫（EHP）是一种微孢子虫寄生虫，感染对虾表现出对虾生长缓慢或生长停滞等症状，影响对虾养殖的正常进行、造成严重的经济损失。自2009年开始，东南亚和我国等多数国家的养殖对虾中均有发现。近几年虾肝肠胞虫的发病规模有所增加，造成的危害也日趋越重。本文从临床诊断的角度出发，简单介绍利用组织印片染色观察的方法快速诊断虾肝肠胞虫的操作及观察结果。
       1.EHP的H.E染色结果
       虾肝肠胞虫个体微小，其成熟的孢子为卵形，大小在0.7～1.1μm，是一种专性寄生的真核生物，主要寄生于细胞内部。通过以往的组织病理（H.E染色）观察可知，对虾感染虾肝肠胞虫初期，EHP孢子仅出现在肝胰腺上皮细胞中、呈现紫红色小颗粒状态。随着EHP的增殖、病情加重，对虾肝胰腺中感染EHP的腺管上皮细胞破裂，成熟的孢子释放到细胞外、整个腺管形成一个坏死灶，此时EHP孢子是游离在细胞外的。

图1  感染EHP的南美白对虾肝胰腺组织石蜡切片，H.E染色结果观察

       2.EHP的革兰氏染色结果
       将确诊感染EHP并通过H.E染色观察到EHP的样品组织，重新切片处理后进行革兰氏染色，此时可以看到，腺管细胞呈现深色的一团，细胞核及EHP孢子均不能分辨。但在肝胰腺腺管崩解较严重的位置、腺管周围及管腔可见较多蓝染颗粒，这就是细胞破裂后释放出来的EHP孢子。此时，EHP孢子呈蓝色、形态较H.E染色大，更易观察。颜色及体型的差异主要与染色液的不同有关。

图2  感染EHP的南美白对虾肝胰腺石蜡切片，革兰氏染色（400×）结果

       3.肝胰腺印片的染色观察
       由前述可知，游离在细胞外的EHP虫体也可以通过印片/涂片的方式固定在载玻片上，通过染色-镜检直接进行观察。操作方法如下：
       （1）取对虾的肝胰腺，剪出一个平整的切面，将切面印/涂在载玻片上；
       （2）滴2滴甲醇等待自然晾干；
       （3）将印片放置在4%甲醛溶液中浸泡10分钟；
       （4）清水冲洗或晾干后，进行常规的革兰氏染色法进行染色：①结晶紫染色液染色1分钟，然后水洗；②碘液媒染1分钟，水洗；③95%酒精脱色30秒，水洗；④番红染色液染色1分钟，然后水洗；
       （5）在染色好的印片上滴2滴清水，盖上盖玻片即可观察。在400×镜下即可观察到明显的蓝色颗粒，也可用油镜直接观察。
       印片观察的关键点主要有两个地方，一是印片甲醇固定后，要用4%甲醛溶液浸泡10分钟，这一步骤是为了洗脱部分粘液，防止染色时粘液着色更重影响孢子的观察；二是观察片子时，如果用400×镜观察，要加盖盖玻片；用油镜观察时则不用加盖玻片。同时，印片染色观察的方法也可以尝试使用对虾粪便进行涂片，依据病理组织的观察结果，病虾肠腔中也会有大量的EHP孢子，理论上粪便涂片染色也具有一定的可行性。

图3  感染EHP的南美白对虾肝胰腺印片，革兰氏染色（400×）

       4.讨 论
       肝胰腺的印片观察可以简便、快速地提供诊断结果，在对虾病害的临床诊断上提供一定的辅助效果。但同时也要注意到本方法的局限性：印片观察只能观察到游离的EHP孢子，意味着此时对虾感染EHP已发展到一定阶段，病虾已表现出一定的症状。印片观察更适用于疾病的诊断。鉴于早发现早干预的原则，在高发季节可以通过定期抽检来跟踪发病情况，此时普通PCR、荧光定量PCR等检测手段，灵敏度更高，可以及时发现感染初期的病虾。

（转自“利洋水产”微信平台）

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印片观察使用方便快捷，适用于疾病的快速诊断