【技术分享】辅助检测在水产动物疾病临床诊断上的应用（七）

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辅助检测在水产动物疾病临床诊断上的应用（七）

唐绍林

       不是所有水产动物疾病临床诊断都能从临床症状、流行特点和水质检测资料中获得诊断线索，特别是对于刚刚从事塘头服务的新人或出现的新发疾病，需要通过PCR病原检测、细菌分离培养和观察，现场涂片、印片后染色观察和石蜡病理组织切片等辅助检查、检测，发现病原、病因或从病理变化上找到诊断的突破口；有些已经提出的初步诊断也需要这些辅助检测手段进一步验证。因此专业的渔医必须具备辅助检查、检测的手段和能力。
       1、PCR病原检测
       PCR技术又称聚合酶链式反应，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。具有特异性强、灵敏度高、速度快、简便易自动化操作等优点，有些公司开发的检测设备可以在药店或塘头检测操作，推动了PCR检测技术在临床诊断上的广泛应用。
       PCR检测技术在新发疾病临床诊断上起到很大的作用，前几年鲤鱼和锦鲤每年都发生烂鳃、眼睛内陷，大量死亡的疾病，药物治疗无效，看症状和流行特点与锦鲤疱疹病毒病十分相似，但病原检测却检测不出锦鲤疱疹病毒，现场服务的渔医都很迷惑，直到通过PCR检测，发病鱼鲤浮肿病毒都呈阳性，才确定是鲤浮肿病毒病。虾肝肠胞虫病也是近些年对虾的新发疾病，简单从生长缓慢的症状无法做出准确诊断，PCR检测是该病各种诊断方法中较便捷的方法。
       PCR检测技术在鉴别诊断和验证初步诊断都起到很大作用。梭子蟹和日本对虾混养池塘在****时经常日本对虾先发病死亡，之后紧接着梭子蟹发病死亡，发病的虾和蟹都表现出体表微微发红的症状，虽然资料上有白斑综合征也有体表微微发红的症状，但在现场仍然不能确定是白斑综合征还是弧菌病。通过取4尾虾进行白斑综合征病毒检测（图1），发现体表越红，电泳出现的条带越亮，说明体内的病毒粒子越多，而症状相对正常，体表不红，肝脏不萎缩，肠道还有少量食物的虾（最下面一尾）就没有条带。检测结果说明主要症状为体表微红的大量发病确是白斑综合征引起的。

图1  对虾白斑综合征PCR检测

       虽然教科书有多数疾病的症状和流行特点介绍，但临床诊断时如果没有PCR检测做参考，出现误诊的几率会很高。如草鱼出血病是春天草鱼春片鱼种的常见病，很多渔医从不用PCR检测做诊断参考，错误地把春片鱼种的“红肠道”症状统统诊断成细菌性肠炎，草鱼春片鱼种春天确实有细菌性肠炎，但目前更主要的是病毒病。新员工起初对当地的疾病缺乏清楚的认识，需要通过病原检测与临床症状、流行特点一一对应，具有了当地主要疾病的临床诊断经验以后，再发病就不必再进行检测。
       近年很多以往没有明确诊断的疾病，临床上都是通过PCR检测技术作为诊断依据（或依据之一）进行临床诊断的，如加州鲈弹状病毒病（“熟身病”），笋壳鱼病毒性神经坏死病、传染性脾肾坏死病，鳜鱼的病毒性神经坏死病（“睡觉鱼”）、黄颡鱼的病毒性神经坏死病，南美白对虾的传染性肌肉坏死病等。
       虽然PCR检测技术应用越来越方便、广泛，临床诊断也不能动辄就做PCR检测，完全依赖PCR检测诊断，它毕竟只是一项辅助诊断的方法、手段。另外也要注意它的局限性，完全可能存在结果的假阳性和假阴性等。
       2、细菌学诊断
       细菌学诊断包括在药店或塘头接种发病动物组织至培养基进行细菌的分离培养，根据培养基的划线部位是否有优势细菌生长，初步判断是否可能有细菌感染；根据选择的培养基种类、培养温度、菌落生长时间、菌落的形态特征以及染色后镜检观察等初步判断可能是哪一类或哪一种细菌，同时用快捷的纸片法做分离菌的药物敏感性试验。有时为了方便快捷，直接无菌操作用发病动物内脏组织涂布到培养基上，贴上药敏片，观察细菌生长情况和药敏结果。细菌种类的判断要结合发病水产动物的临床症状、流行情况，进行综合判断。如果按照以上方法不能初步判断分离菌的大致种类，需把分离菌送实验室做准确的细菌鉴定，对于大规模严重发病时，需要做攻毒试验确定是否为致病菌。

图2  细菌学临床诊断过程

       普通淡水鱼或疑似气单胞菌、爱德华氏菌、诺卡氏菌感染常选择TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂培养基）；对虾或疑似弧菌感染选择TCBS培养基（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基），而气单胞菌在TCBS培养基上不生长或形成营养不良的小菌落，因此在海水养殖动物上可以选择TSA和TCBS两种培养基来区别可能是气单胞菌还是弧菌感染；怀疑链球菌感染一般选择BHI培养基（脑心浸液琼脂培养基）。以上常见致病菌也都能在TSA培养基上生长，如果条件**，也可以都选择TSA培养基进行分离培养。相同培养条件下，不同种细菌的生长速度不同，如气单胞菌比迟缓爱德华菌速度快几个小时，诺卡氏菌速度会更慢。链球菌要求的培养温度最高，30℃以上生长更快。而诺卡氏菌在25～28℃培养生长最快，超过30℃可能不生长。临床实践中需要勤操作、多观察，不断总结经验。
       常见的致病菌如气单胞菌、爱德华氏菌、诺卡氏菌、弧菌、链球菌，菌落特征明显，为初步判断细菌种类提供依据。如在TSA培养基上，气单胞菌形成圆形光滑、边缘整齐、湿润、稍隆起不透明或半透明灰白色或黄色馒头状大菌落；弧菌形成圆形、稍隆起、湿润透明或半透明灰白色菌落；迟缓爱德华氏菌形成圆形、边缘整齐、光滑、湿润半透明或透明的灰白色小菌落；诺卡氏菌形成沙粒状、干燥、不透明橘色或黄色边缘不整齐菌落；链球菌形成圆形、边缘整齐、湿润，针尖大小的透明小菌落（图3）。弧菌在TCBS培养基上形成圆形、隆起的湿润黄色或绿色菌落，常见的副溶血弧菌、创伤弧菌形成绿色菌落，哈维氏弧菌、溶藻弧菌形成黄色菌落。

图3  以上分别为气单胞菌、迟缓爱德华菌，诺卡氏菌、链球菌菌落形态特征

       分离菌革兰氏染色后镜检观察，也是对细菌简单易行的初步鉴定方法。不同的感染部位也是细菌的特征之一，如从罗非鱼脑部分离的菌更趋向于链球菌，黄颡鱼等无鳞鱼脑部分离的菌更趋向于鮰爱德华氏菌或链球菌。把临床症状、流行特点和细菌学诊断结合起来，对判断细菌的种类更有实用价值。近几年临床上利用简单易行的细菌学诊断对一些以往不熟悉的疾病诊断起到十分重要的作用，如黄颡鱼的链球菌病，淡水鱼加州鲈、鳜鱼、鲤、鲫、鲮鱼等的迟缓爱德华菌病，黄颡鱼的肺炎克雷伯氏菌病等等。
       3、印片、涂片、石蜡组织切片
       现场取发病组织做印片或涂片，染色后镜检观察，可以观察到细菌、寄生虫或一些特征性的病理变化如肿大细胞等，作为临床诊断的提示方向或依据。如海鲈体表出现囊肿，取内容物涂片、染色后见大量诺卡氏菌菌丝（图4左1）。加州鲈体表出现浅表性溃疡，但内脏没有出现白色结节，取肾脏组织涂片后染色也能见到诺卡氏菌菌丝（图4左2），都提示有诺卡氏菌感染。疑似链球菌病的黄颡鱼脑部涂片也能见到链球菌菌丝（图4左3）。

图4  海鲈囊肿和加州鲈肾脏涂片可见诺卡氏菌菌丝，黄颡鱼脑部涂片见链球菌

       罗非鱼的立克次体病（弗朗西斯菌病）近年在部分地区发病率较高，印片也是临床诊断最简便的方法，在脾、肾组织中的巨噬细胞胞质内能观察到蓝紫色、球状或颗粒样、成簇的菌体（图5）。

图5  罗非鱼脾（左）、肾（右）组织中观察到蓝紫色的菌体

       与现场涂片、印片比较，石蜡组织切片操作繁琐，用时长，不适合在药店和现场做疾病临床诊断上应用，但作为有一定规模的公司为一线人员提供技术支持十分必要。通过病理组织切片发现特征性病理变化，为临床诊断提供指示和依据；对于新发疾病或疑难杂症通过石蜡组织切片找到主要发生病理变化的器官、组织和具体发生了哪些病理变化，为诊断和认识疾病的本质有重要意义。如加州鲈“熟身病”的诊断，首先通过组织病理切片发现脑部组织发生空泡化，是主要靶器官，之后针对脑部组织做PCR检测弹状病毒病都呈阳性，初步确定“熟身病”的病原。
       常见的特征性病理变化有：
       （1）包涵体
       很多病毒感染水产养殖动物后都会形成包涵体，是诊断疾病的重要依据。2015年珠三角地区很多池塘养殖的罗氏沼虾发生了以额剑基部甲壳下（触角腺）发白为主要症状的疾病，死亡率较高，病理组织切片发现在触角腺细胞胞质内出现蓝染、荷包蛋样包涵体（图6），结合流行特征，当时就初步诊断是一种病毒病，后来有研究报道是虾血细胞虹彩病毒病（十足目虹彩病毒1）。对虾杆状病毒在肝胰腺腺管上皮细胞核内形成红染三角锥形包涵体，肝胰腺细小病毒状病毒在肝胰腺腺管上皮细胞核内形成蓝染、圆形、与核仁间形成明显透明带的包涵体，黄头病毒在淋巴器官、血细胞和结缔组织细胞中有细胞质包涵体等，为这些疾病的临床诊断提供重要依据。

图6  罗氏沼虾发病虾和触角腺细胞内的包涵体

       （2）肿大细胞
       近年来海水鱼和部分淡水鲈形目养殖鱼类如鳜、褐篮子鱼、美国红鱼、笋壳鱼、海鲈、石斑鱼、尖吻鲈、大口黑鲈的细胞肿大属虹彩病毒病（传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒）发病率很高，这些疾病的临床诊断除了利用PCR检测病毒以外，组织病理切片观察见脾脏、肾脏、肝脏、肠道、鳃丝等组织肿大细胞（图7），也进一步验证了细胞肿大属虹彩病毒病的初步诊断。

图7  鳜脾肾组织肿大细胞

       （3）组织空泡化
        近年临床上对海水鱼和部分淡水鱼的病毒性神经坏死病的临床诊断，除了利用PCR检测病毒以外，组织病理切片观察见脑、眼组织出现该病的特征性病理变化即空泡化（图8），是该病临床诊断的主要依据，特别是一些养殖鱼类如鳜鱼、笋壳鱼、黄颡鱼等以前未见报道该病毒感染，特征性病理变化为该病的临床诊断提供了有力证据。

图8  石斑鱼脑眼组织空泡化

       （4）气泡印迹
       气泡病的诊断由于气泡消失快，给临床诊断带来困难。临床上除了依据水质、天气特点和症状对气泡病进行诊断外，利用组织切片发现气泡印迹是诊断气泡病的重要依据。如能引起南美白对虾肌节间和腹部末端肌肉发白的原因很多，气泡病是其中原因之一，如何确定是气泡病引起的，可以通过病理组织切片观察肌肉、眼、鳃、肝胰腺、触角、心等组织、器官的气泡印迹，尤其对虾中、后段肌肉组织气泡印迹更集中（图9），可以诊断是气泡病引起的。

图9  对虾正常肌肉组织（上）和气泡印迹（下）

       （5）特征性的坏死灶  
       有些病原感染会在组织中形成特征性的坏死灶，如诺卡氏菌感染会在肝、脾、肾、鳃等组织出现具有明显三层结构的结节性坏死灶；丝囊霉菌感染会在肌肉组织形成典型的丝囊霉菌坏死灶，坏死灶中间为丝囊霉菌菌丝，周围为增生细胞。

图10  诺卡氏菌结节性坏死灶（上）和丝囊霉菌坏死灶（下）

       （6）细胞核肿大细胞
       甲壳类如南美白对虾、克氏原螯虾、脊尾白虾、河蟹等感染白斑综合征病毒后会在鳃、胃、表皮等组织观察到细胞核肿大现象，是白斑综合征诊断的依据。

图11  南美白对虾鳃丝细胞核肿大

（转自“利洋水产”微信平台）

素人渔夫

组织印片和切片对于有特征性变化的疾病有很好的辅助诊断作用

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仅介绍了一些目前常见的辅助检测用于临床诊断方法。这个内容多年来一直作为公司内部培训的一部分。