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卤虫是凡纳滨对虾幼体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的载体
Suzianny Maria Bezerra Cabral da Silva(巴西，2015年)
摘要
在2004年，巴西南美白对虾养殖产量下降，被认为是感染传染性肌坏死病毒（IMNV）的原因。在健康养殖程序中，需要对活饵料进行筛选才能减少病毒在生产中的流行。水产养殖中的活饵料，卤虫（盐水丰年虫）对甲壳类的早期培育和成熟至关重要。本研究旨在讨论卤虫通过浸没和浮游植物粘附传染对IMNV的易感性，并阐明它作为病毒载体将其传染给南美白对虾的角色。卤虫成体通过这两种方式均感染了IMNV，是通过PCR阳性反应验证的。然而，感染的卤虫没有表现出感染的迹象。投喂通过植物粘附传染的卤虫，南美白对虾感染IMNV的概率超过40%；而投喂通过浸没的卤虫只有10%的感染率。卤虫通过浸没与植物粘附传染的平均病毒载量直接存在显著性差异（P≤0.05）。而且，通过植物粘附传染和已经感染的组织的平均病毒载量的总RNA分别为134和14800 copies/ug-1，它们之间的差异不显著（P≥0.05）。结果表明，在本实验条件下，卤虫充当了IMNV的传播载体。虽然投喂感染IMNV的卤虫并没有造成南美白对虾大量的死亡，但是卤虫作为一个IMNV的来源，不应该被忽视。
1 前言
卤虫是海洋鱼类和甲壳动物孵化场最常用的水产养殖活饵料（Sorgeloos et al., 2001;
Sui et al., 2013）。尽管卤虫的无节幼体和成虫不能像自然界中的浮游动物一样，被各种培养的水生生物消耗，但它的休眠卵能够长时间储存，使得它成为了水产养殖通用的活饵料（Sorgeloos等人，1998年，2001年）。然而，没有经过处理的活饵料可以成为细菌或病毒的载体（Sivakumar et al., 2009）。
一些调查研究表明，卤虫是甲壳类病原体易感寄主的病原储存库、载体或来源。Li et al. (2003) and Zhang et al. (2010)对不同幼体阶段的卤虫感染白斑综合征病毒（WSSV），发现其垂直传播，从龄期到成虫，再由成虫到休眠卵。此外，罗氏沼虾肌肉白浊病（WTD）和肝胰腺细小病毒（HPV）也能够感染卤虫的。罗氏沼虾肌肉白浊病（WTD）是由罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）和超小病毒（XSV）引起。它（WTD）已经被确定，在卤虫（无节幼虫、后无节幼虫、幼体、亚成虫、成虫）病毒感染后，在所有的生长阶段，分子分析100%的阳性(Sudhakaran et al., 2006)。同样，实验感染卤虫的不同生长阶段，通过PCR表明HPV均为阳性，它通过横向传播到斑节对虾的幼体后期(Sivakumar et al., 2009)。
对于感染性肌坏死病毒（IMNV），没有具体的作为载体的数据。然而，它是无包膜的病毒颗粒结构。随着饵料，它就有可能残留并感染个体的胃肠道(OIE, 2012)。因此，该病毒的传播，在其它的无脊椎动物中，也被认为是通过摄食病毒颗粒完成的。IMNV在巴西，第一次出现和报道是在2002年的皮奥伊州（巴西）南美白对虾成虾养殖场。其特点为濒死的虾由于骨骼肌坏死，导致其腹部肌肉透明度降低；开始时，每天的死亡量为7g (Nunes et al., 2004)。在2006年，印尼的对虾养殖场爆发IMNV（Senapan等，2007）。从它出现到2010年，，造成的经济损失超过十亿美元(Lightner et al.,2012)，这导致国际兽医组织(OIE)将IMNV列入甲壳动物疾病监测名录(OIE, 2007)。因此，为了防止对虾疾病在养殖农场的传播，动物健康管理计划已经通过了，在培养体系中所有的易感物种进行监测，其中包括使用的活饵料(Chang et al., 2011)。因为，卤虫在孵化和成熟的过程中是最广泛使用的活饵。所以，本文旨在评估卤虫对IMNV的易感性及其作为IMNV的载体，水平传播给南美白对虾的这一角色。此外，这是第一份，在实验条件下描述IMNV载体的报告。
3 结果与讨论
浸没和病毒浮游植物附着两种处理卤虫的感染途径，IMNV检测均为阳性（图1）。然而，我们发现这两种感染途径，没有导致临床症状或者出现累积死亡率。而且，用未感染的卤虫进行IMNV阴性对照（常规PCR，数据未显示），其任何样品也没有任何感染迹象。
图1 常规PCR扩增卤虫通过浸没（样品1和2）和浮游植物粘附（样品3和4）感染的IMNV；C +（阳性对照）；C -（纯水，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）；M（100 bp的分子梯；Invitrogen公司，美国）。
以前的研究报告表明，在卤虫成虫中，对不同的对虾病毒检测，呈阳性。Li et al. (2003)评估卤虫无节幼体和成虫对WSSV的易感期为10天，它是通过接种用PCR鉴定携带WSSV的混合微藻粉末来完成的。在这项研究中，也有类似于WSSV垂直传播的结果，卤虫的成虫显示阳性，其产生的休眠卵也呈阳性。但它孵化出的无节幼体呈阴性，猜测是漂洗是去除的。Chang et al. (2002)对WSSV呈阳性的休眠卵，孵化出来漂洗后的无节幼体，检测呈阴性，这表明WSSV对卤虫的污染在其外部。此外，这两个研究中，没有对疾病的临床症状进行观察。Li et al. (2003)表明卤虫感染WSSV，其病理持续时间还需要研究。
另一项研究中，WSSV通过浸没和病毒对浮游植物粘附对卤虫的四个发育阶段（无节幼虫、后无节幼虫、亚成虫、成虫）进行感染。然而，只有病毒对浮游植物粘附感染的方式通过两步PCR呈阳性，而且只是表现出了低病毒量（Zhang等人，2010）。同样的方式，实验室感染通过巢式PCR检测，WSSV对（）轮虫、枝角类、克氏纺锤水蚤桡足类通过病毒对浮游植物粘附感染的方式呈阳性（Zhang等人，2006年，2007年，2008年）。
Liu et al. (2007)培养六种藻（等鞭金藻，中肋骨条藻，小球藻，赤潮异弯藻，锥状斯氏藻和盐藻），通过藻类附着的WSSV感染日本囊对虾。他发现，除了赤潮异弯藻，其它全是来自水库的WSSV，巢式PCR检测呈阳性。此外，小球藻、锥状斯氏藻被证明，它们储存WSSV的量最多。然而，当日本囊对虾幼体通过微藻重新感染时，只有小球藻成为载体，提供了传播途径。这表明，微藻可以作为WSSV的水平传播途径(Liu et al., 2007)。
Zhang et al. (2010)表明，WSSV传染给浮游动物，病毒对浮游植物粘附是一个有效的传播途径。在本研究中，浸没和病毒对浮游植物粘附感染卤虫成体，这两个传播途径通过阳性PCR结果，被证明是有效的。其平均病毒载量，用总RNA含量表示，其远超过105 copies/ug (Silva et al., 2011)。
除了病毒对浮游植物的粘附途径，虾类病毒对卤虫的感染已经有采用口服途径的。Hameed et al. (2002)用浸没和口服米糠、病毒悬液混合物两种方式研究WSSV对卤虫（无节幼虫、后无节幼虫、幼体、亚成虫、成虫）不同生长阶段的病理情况。在两种情况下，对所以的生长阶段的病毒情况进行检测。但是，对虾杆状病毒使用类似的感染途径，Sarathi et al. (2008)在卤虫的五个相同阶段没有检测到对虾杆状病毒，主要表现在巢式PCR结果为阴性。
在卤虫的所有生长阶段，罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）和超小病毒（XSV），通过口服食物、病毒悬液混合物，是有效的途径，卤虫各个生长阶段的巢式PCR结果均为阳性。这表明，卤虫是这些病毒的储存器(Sudhakaran et al., 2006)。
除了无节幼体，卤虫的发育阶段，通过口服食物、病毒悬液混合物感染HPV结果均呈阳性(Sivakumar et al., 2009)。然而，还需要进一步研究，以确定这个物种是否真正感染了HPV，或者只是一个被动载体。虽然Feng et al. (2013)报道，卤虫的细胞膜上存在WSSV受体，但这只是表明这种小型甲壳动物是它的储存库。
将卤虫作为IMNV感染南美白对虾幼体水平传播的载体进行分析，其实时定量荧光PCR结果全部是阳性。然而，南美白对虾幼体投喂由病毒对浮游植物粘附感染的卤虫和剁碎的感染病毒的南美白对虾组织时，南美白对虾幼体对病毒的感染率均超过40%，它们两者的平均病毒载量间无显著性差异（P≥0.05）（表1）。
表1 南美白对虾的摄食分为四组，为摄食浮游植物粘附感染的卤虫、浸没感染的卤虫、剁碎的已经感染的虾组织、未感染的卤虫，各组导致南美白对虾感染的数量和平均载毒量
相比之下，这几组的平均载毒量，在南美白对虾幼体投喂浸没处理的卤虫这组，差异比较明显（P≤0.05），这组南美白对虾幼体只有10%被感染（表1）。可能是南美白对虾幼体投喂浸没处理的卤虫这组里面有零滴度（没有感染）的存在，使得数据分布差异大，从而导致它与其它组间的差异显著。
我们的数据证实，IMNV对浮游植物粘附感染的途径效率更高，同我们的预期一样。没有病毒载量的为南美白对虾幼体投喂没有感染IMNV卤虫的对照组。
Zhang et al. (2010)表明，微藻表面存在病毒粒子，卤虫通过滤食作用，使得其在体内蓄积，最后病毒粒子被传播到摄食了这个小型甲壳动物的虾身上。虽然在实验中，作者没有观察到大规模的死亡，但投喂了预先用浮游植物粘附感染WSSV的卤虫后，所有的虾都检测出了WSSV（巢式PCR）。
一般情况下，其途径还包括通过卤虫摄取病毒粒子，如病毒悬液混合米糠。这种水平传播的途径已经在罗氏沼虾和斑节对虾幼体后期的MrNV，XSV和HPV上得到了证实(Sudhakaran et al., 2006; Sivakumar et al., 2009)。
在所有的实验组中，只有南美白对虾幼体投喂剁碎的感染IMNV的南美白对虾组织的平均病毒载量与自然感染虾的相似(总RNA含量3.09 *10 4-6.85 *10 8 copies/u g) (Silva et al., 2011)。而且，是唯一一组试验虾发现临床症状的组别，其腹部和腹肢透明度下降。
这些结果与Silva et al. (新闻报道)的相比有差别。它对试验虾每天投喂其体重4%剁碎的感染IMNV虾的肌肉组织，其结果没发现明显的疾病症状，也没有同自然环境感染相似的平均病毒载量。
在所有的组别中，在实验培养条件下（无病毒），累积死亡率控制在预期的范围之内，没有观察到大量的死亡（表2）。卤虫通过浸没和浮游植物粘附感染WSSV，摄食后的南美白对虾没有大量的死亡，其各组间的死亡率差异不明显(Zhang et al., 2010)，这与我们的结果是一致的。
表2 南美白对虾的摄食分为四组，为摄食浮游植物粘附感染的卤虫、浸没感染的卤虫、剁碎的已经感染的虾组织、未感染的卤虫，各组导致南美白对虾累积死亡率的情况
4 结论
本研究结果表明，卤虫有两种容易感染IMNV的方式（浸没和浮游植物粘附感染）。在本实验条件下，卤虫作为载体，将IMNV水平传播给南美白对虾。此外，投喂感染IMNV的卤虫，虽然在15天内没有发现大量的死亡，但它在养殖场作为IMNV的来源，不应该被忽略，它会增加病原体的流行。
另一点就是，这些结果表明，对于IMNV来说，它有选择性繁殖的情况，而人工感染只能通过肌肉注射(White-Noble et al., 2010; Silva et al., In press)。因此，我们的结果强调了，卤虫是一种有效的可替代的感染方案（实验室方案比较费力）。（利洋公司技术部 陈明卫 译）
卤虫是凡纳滨对虾幼体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的载体1.pdf
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发表于 2015-4-30 14:01:13
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