水产动物病原菌药敏试验

水中宝

临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test法），和自动化仪器等。水产微生物最常用到的是纸片扩散法。
纸片扩散法：该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC（最小抑制浓度）呈负相关。

一、实验材料
1、培养基：
目前水产常用的有以下几种

2、药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）
3、细菌：待做药敏试验的细菌（包括水产动物病变组织、体液或已分离培养的菌种等）
4、仪器：解剖剪、镊子、接种环、酒精灯、移液器、滴头。

二、实验准备
1、药液的制备：按商品药的使用治疗量的比例配制药液，如取“氟多力”80～100微克加入1ml的水中混匀，可按这个比例配制药液。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。
2、药敏片的准备
1）取定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15～20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
2）在上述含有50片纸片的瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3～6个月。

三、实验操作方法
1、细菌涂布
1）取病变组织或体液（肝、脾、肾，肠脓液等），轻轻在平板上均匀涂一层。
具体方式：用灭菌解剖剪和镊子，剪取动物病变组织；或用灭菌棉拭子蘸取病变部位体液，在平板上轻轻涂布均匀。此方法适合临床快速确定选择用药。
2）若已做细菌分离培养，可直接用经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。）
2、贴药敏片
将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要在培养皿上标注。
3、培养
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

四、结果观察
在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

五、判定标准
药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。

六、应用
药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给水产动物用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在治疗水产动物疾病时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

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微生物试验中病原菌的人工培养温度一般为35-37℃，培养时间多数为18-24h，但有时也要根据菌种及培养目的做最佳选择。比如链球菌、爱德华氏菌最适生长温度为37℃，弧菌一般30℃下培养，气单胞菌属一般在28℃培养，假单胞菌15-20℃生长最好。至于哪一种菌在此温度下能不能培养出来，最终还是要看实验结果。
上述数据只是查阅相关资料总结出来供大家学习参考，有些不完善的地方欢迎纠错补漏。

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药店因为还不具备恒温箱等设备，一般在常温下培养也是可以的。培养基、药敏片研究所都可以为药店提供，药店申请就可以了。

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傅财华 发表于 2013-7-24 21:47
这在药店的实际应用上有哪些帮助？

这只是为大家提供一个操作上的指导建议，药敏试验在很多药店已经在做了，可以帮助大家在用药选择上提供一定依据，减少盲目用药。