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NO 3−对南美白对虾的慢性毒性：存活率、生长、须长及病理变化
David D. Kuhn 美国 2010年
摘要：在对虾的养殖中，硝酸盐（NO 3- ）的慢性毒性尚无证据可查。要解决这个问题，就在实验室循环水养殖系统中，确定它对南美白对虾的生长、存活、系统中总的对虾数量（对虾生物量）、虾须长度和组织病理变化的影响。第一个实验（A）养殖6周的时间，养殖盐度为11‰，对照组（A）的硝酸盐（NO 3- ）浓度为35 ppm，其它组的硝酸盐（NO 3- ）浓度分别（A1）220ppm、（A2）435ppm、（A3）910ppm。在存活率、生长、对虾生物量、虾须长度方面，对照组A与A1组间的差异均不显著。A2组与A组间，在存活率和生长方面差异不显著，但在对虾生物量和虾须长度方面差异显著（P<0.05）。最后，A3组与A组间，在存活率、生长、对虾生物量、虾须长度方面的差异均显著（P<0.05）。对照组和A1、A2、A3的组织病理学表明其肝胰脏出现了损伤，在3个试验组中有极少数的虾鳃异常，如挂脏。第二个试验（B），养殖5周的时间，来评价养殖盐度变化时，硝酸盐（NO 3- ）浓度升高的影响。试验对照组（B）的养殖盐度为9‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为18ppm。B1组的盐度为9‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。B2组的盐度为2‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。B3组的盐度为18‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。不考虑盐度时，B1、B2、B3组与对照组B相比，它们之间在存活率、生长、对虾生物量方面差异显著（P<0.05）。尽管B1、B2、B3组虾对升高的硝酸盐（NO 3- ）浓度，为440ppm，表现出了消极反应。但在硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm时，随着养殖盐度的升高，虾的存活率和对虾生物量显著增长（P<0.05）。
1 前言
2 材料与方法
2.3 实验设计
两个实验均有四个水平，每个水平三个平行。实验A为在升高硝酸盐，养殖盐度为11‰时，对南美白对虾养殖42天进行研究。对照组（A）的硝酸盐（NO 3- ）浓度为35 ppm，其它组的硝酸盐（NO 3- ）浓度分别（A1）220ppm、（A2）435ppm、（A3）910ppm。实验B养殖35天，不同养殖盐度下，对硝酸盐的浓度对南美白对虾的影响进行研究。试验对照组（B）的养殖盐度为9‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为18ppm。B1组的盐度为9‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。B2组的盐度为2‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。B3组的盐度为18‰，硝酸盐（NO 3- ）浓度为440ppm。
2.4 水质
养殖水体是用井水和海水晶调配而成（海水晶产自美国）。硝酸盐的水平在实验室内用硝酸钠来控制（舍尔化工，美国）。一些硝酸盐在实验中会自然积累，水体的蒸发也会使得硝酸盐的浓度升高。因此，在实验中，在同一时间向每个玻璃缸中加入等量的水，以补充蒸发损失的水。实验中，水质检测方法和样品取样数量见表1。
3 结果
3.1 不同程度的硝酸盐对虾的影响
同预期的一样，在硝酸盐的各个水平，每组间的差异均显著（P<0.05）（表2）。水质指标没有观察到差异，这使得各组间的比较有意义。
表2 水质指标及A和B的单因素方差分析，上标表示差异显著。
实验A的存活率在硝酸盐大于220ppm时受到影响（图1）。最终的存活率分别为：A 组87.1±4.0％，A1 组87.4±9.5％，A2 组64.2±10.7％，A3组 14.6±4.2％。在14天后，A3组的存活率要显著低于A组、A1组和A2组的。
图1 A实验存活率情况
虾的生长与硝酸盐的水平呈负相关，从养殖的21天起，各组间生长的差异显著（P<0.05）（图2）。实验结束时，A3组的虾要显著小于其它组的。最终的生长率分别为：A 组1.00±0.12克/周，A1 组0.84±0.06克/周，A2 组0.70±0.13克/周，A3组0.24±0.18克/周。
图2 A实验生长情况
虾的生物量变化如图3。养殖14天后，各组间生物量的差异显著（P<0.05），且生物量与硝酸盐的水平呈负相关。最终的生物量分别为：A 组158±7 g/缸，A1 组138±24 g/缸，A2 组86±14 g/缸，A3组41±25 g/缸。
图3 A实验生物量情况
硝酸盐浓度的升高，对虾须的长度产生负面影响（见表3）。A组的虾须长度显著长于A2组和A3组（P<0.05），A3组虾须的长度要显著短于其它组的（P<0.05）。
表3 A实验虾须长度的情况
A实验中，A1组、A2组、A3组的肝胰脏中均有病灶（图4）。肝胰腺管呈各种病变，一些肝胰腺管数目和尺寸减小，变为储存脂质的空泡。还有一些肝胰腺管缺乏上皮细胞，导致其膨胀扩张。这两种肝胰腺管都含有脱落的上皮细胞和细胞碎片。还有一小部分的肝胰腺管中有类似肉芽肿外观的东西，是坏死的、以细菌填充为中心的物体。从A1组到A3组，仅有极少数虾的鳃异常（图5）。细菌和没有固定形态的碎片，在许多虾的鳃丝上积累，而一些鳃的柱状上皮结构出现了损伤。
图4 实验A中，硝酸盐升高后，肝胰脏典型的病变，放大250倍的照片。一部分的肝胰腺管中有类似肉芽肿外观的东西，是坏死的、以细菌填充为中心的物体（g）。而其它小管扩张，缺乏上皮细胞（X）。这两种类型的小管在不同程度上含有脱落、坏死的上皮细胞和细胞碎片。
图5 实验A中，硝酸盐升高后，虾鳃典型性的挂脏，放大倍数为500倍。细菌和没有固定形态的碎片，在许多虾的鳃丝上积累（*），而一些鳃的柱状上皮结构出现了损伤（箭头）。
3.2 实验B：提高硝酸盐浓度在不同盐度下的影响
正与预期的那样，当硝酸盐变化时，盐度对各组的影响均显著（表2）。尽管溶氧和亚硝酸盐在各组间差异显著（P<0.05），但溶氧和亚硝酸盐的平均值均分别大于5.75 ppm或者小于0.26 ppm。
养殖一周后，实验B的存活率在各组间差异明显（P<0.05）（图6）。B2组在养殖14-21天时，死亡率出现了100%。在养殖的28天，存活率在所有的组别都显著的低于对照B组（P<0.05）。在硝酸盐浓度升高时，虾的存活率与盐度呈负相关。最终的存活率：B组81.5±4.9%，B1组16.7±11.1%，B2组为0，B3组44.4±5.6%。
图6 B实验的存活率情况
在硝酸盐浓度升高时，虾的生长与盐度呈负相关。且在养殖14天之后，各组间生长的差异显著（P<0.05）（图7）。对照B组的生长速度最快。虾在硝酸盐水平较高时，其生长速度在盐度为9和18时（即B1与B2组之间），它们之间的差异不明显。在B2组，养殖14天时，虾没有生长。养殖到20天时，全部死亡，死亡率为100%。最终的生长情况：B组1.07±0.06克/周，B1组0.51±0.08克/周， B3组0.59±0.11 克/周。
图7 B实验中单个虾体重的情况
虾的生物量变化如图8。在养殖7天后，B组与其它组间差异显著（P<0.05）。在硝酸盐浓度升高时，盐度降低，对虾的生物量有负面影响。最终的生物量情况：B组114±2 g/缸，B1组15±24 g/缸，B3组41±4g/缸。
图8 实验B的虾生物量的情况
4 讨论
本研究表明，在养殖盐度为11，硝酸盐的浓度为220ppm时，虾可以养殖6个星期。同时，硝酸盐的浓度为435ppm，对虾的养殖是不安全的。蔡和陈在2002年，根据Sprague1971年的实验数据，设计了斑节对虾的硝酸盐急性毒性试验的浓度梯度。在养殖盐度为15时，硝酸盐的安全浓度在南美白对虾养殖时估测为145ppm。尽管没有发表的文献表明硝酸盐的毒性，但是有文献对南美白对虾硝酸盐的安全浓度做出了建议。Van Wyk在1999年提出，对虾养殖硝酸盐的安全浓度要低于60ppm，但是没有提供科学依据。本实验从数据上支持了这一说法，但是他提出浓度的3.5倍以上（硝酸盐浓度220 ppm）。硝酸盐浓度在220 ppm，虾养殖几个星期后，虾的产量可能不会降低。当考虑到水和其它方面（如，能源使用，盐，水排放等）的资源节约的循环水养殖操作时，这种差异是显著的。如，若硝酸盐的含量是主要的关注变量，那么虾农在理论上就可以减少一半的换水率。
本实验对虾须长度进行了评估，因为它反映了虾的整体健康情况。虾须的主要作用是触角和感官知觉(New et al., 2010)。此外从活虾市场的角度考虑，有些消费者可能不接受虾短须(Gardner, 2010)。当硝酸盐的浓度在435ppm以及更高时，虾须的长度不被接受，因为要显著短于低浓度的。虾须损伤或较短，是虾不健康的早期症状(FAO, 2001)。或许，在本研究中，升高硝酸盐的浓度，打破了蜕皮激素内分泌的控制。在甲壳类动物中，记载了蜕壳和再生附属物是相互关联的(Madhavan and Madhavan, 1981)。尽管目前确切的机理尚不清楚，当虾在高水平的硝酸盐浓度的环境中持续一段时间后，虾须就没有再生的能力了。
实验A的3个处理组，在硝酸盐浓度升高时，均表现出了不同程度的组织病变，尤其是肝胰脏和鳃。一些肝胰腺管数量减少，形成储存脂质的空泡。还有一些小管扩张，缺少上皮细胞。这表明虾可能摄食不正常或者代谢异常(Villalon, 1993)。还有少数的肝胰腺管内出现了肉芽肿状的物体，表明它对损伤产生了炎症反应或者损伤的肝胰腺细胞、上皮细胞对损伤组织进行包被(Jiravanichpasal and Miyazaki, 1994; Estevea and Herrerab, 2000)。细菌和形状不规则的碎片，在许多虾的鳃丝上积累。这个可能是虾的清洗活动较少，或者是水中的悬浮物质较多造成的(Bauer, 1977, 2002; Martin et al.,2000)。有少数的虾鳃挂脏，报道说鳃挂脏会影响鳃部的水体交换，最后对虾体的健康造成不利影响(Bauer, 1979)。所有的这些变化表明，硝酸盐浓度的升高对虾的健康造成了不利影响，尽管虾体的表面体征不明显。实验B表明，硝酸盐在盐度较高的毒性较低。这些结果与其它报道的，除了硝酸盐以外的含氮废物毒性的强弱变化，随盐度的变化相一致(Linand Chen,2001;KirandKumlu,2006;Lietal.,2007)。对于硝酸盐来说，,Tsai and Chen在2002年发现，当养殖盐度从35降低到15ppm，硝酸盐对斑节对虾的毒性增强。虽然高盐度对含氮物质的毒性的抑制作用还没有搞明白，但据说，海虾在低盐度的环境中，它会受到附加的压力，代谢和其它相关物理过程会受到压制。虾的等渗点为18.5ppm，Castille and Lawrence在1981年报道其平均值在24.6ppm，Wyban and Sweeney在1991年报道其在10-15 ppm。离子交换（包括硝酸盐）的主要地点在虾的鳃部(Pequeux, 1995)。对虾在低盐度时，其血淋巴需要保持较高的渗透压对抗环境。如果这时是低渗状态就需要额外的消耗能量(Pequeux, 1995)。因此，毒性物质在长期威胁或短期之间进行比较时，少量的能量还是能够用来抵御毒性的。此外，低盐度时，在体内渗透压条件较低时，可以将水体中过多的硝酸盐吸入体内，对体内的渗透压进行调整(Mantel and Farmer, 1983; Kir and Kumlu, 2006)。
抑制生长和死亡的原因可能主要包括代谢阻碍、摄食率降低以及损伤内分泌功能(Kurihara et al., 2008)。在水产养殖中，人们普遍认为毒物在导致其死亡前，抑制其生长。然而，在本实验中，硝酸盐浓度升高，对存活率的影响程度要大于对生长速度的影响。这一点尤其值得注意，因为虾农通常是依赖准确的生长数据，但确得不到准确的养殖数量，因为想知道养殖池塘中具体有多少虾比较困难。
5 结论
总体上，这个硝酸盐的慢性毒性研究表明，在养殖盐度为11，硝酸盐浓度大于220ppm时，硝酸盐对南美白对虾的存活、生长和对虾生物量产生负面影响。硝酸盐的浓度在循环水养殖中已经报道超过了450ppm (Kuhn et al.,2009; Samocha Et al., 2010)。硝酸盐对存活率的抑制要超过对生长率的抑制。盐度降低，硝酸盐的毒性增强。硝酸盐对虾的慢性影响主要包括抑制虾须的生长、损伤肝胰脏，还有少数虾的鳃异常，如挂脏。本研究有助于水产从业者和虾农更好的管理养殖系统，避免硝酸盐带来的危害。
利洋公司技术部陈明卫 译
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发表于 2015-6-25 16:30:59
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